細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)新方法（二）--實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞動態(tài)

案例：細(xì)胞作為趨化因子

上篇ibidi細(xì)胞趨化應(yīng)用中（見鏈接：   ）以Dendritic cell對CCL19細(xì)胞趨化反應(yīng)為例介紹了細(xì)胞趨化的新方法。

本案例將介紹如何用細(xì)胞作為細(xì)胞運(yùn)動的化學(xué)趨化因子。

如圖所示：觀測通道中可以使用貼壁細(xì)胞，或者是3D培養(yǎng)的細(xì)胞。用于趨化的細(xì)胞可以直接注入其中一個儲液池中（圖一）。

圖一：A待觀察細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，受到左邊的儲液池中細(xì)胞影響具有了趨化行為。B待觀察細(xì)胞為3D培養(yǎng)細(xì)胞，在基質(zhì)膠中同樣也受到了儲液池中的細(xì)胞的影響具有趨化行為。

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：

1. 儀器：

• 細(xì)胞培養(yǎng)箱（高濕度，37℃，5%CO2）
• 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時(shí)拍照功能
• 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
• 可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統(tǒng)
• 分析軟件：可選用手動分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊，或全自動的ibidi提供的WimTaxis進(jìn)行細(xì)胞軌跡追蹤。后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1. 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：

實(shí)驗(yàn)前一天準(zhǔn)備工作：

為了減少ibidi細(xì)胞趨化載玻片與培養(yǎng)基中的氣泡，將載玻片和培養(yǎng)基提前24小時(shí)放入培養(yǎng)箱中

                                 表三：制備1.6mg/ml 基質(zhì)膠

操作步驟：

• 使用表一中的培養(yǎng)基制備  9 x 106 cells/ml 的細(xì)胞懸液
• 在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號試劑，避免產(chǎn)生氣泡
• 在另一1.5ml離心管中準(zhǔn)備150 μl  collagen I
• 使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl（圖一A）
• 小心混勻（圖一B），避免產(chǎn)生氣泡
• 加入90μl細(xì)胞懸液到上一步混合液中（圖一C）
• 小心混勻（圖一D），避免產(chǎn)生氣泡

圖一：制備細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液圖示，注意：1）避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會破壞膠原纖維，不能使用Vortex；2）膠原混合后，離膠凝大約有5分鐘時(shí)間，如果在凝膠后再進(jìn)行操作會破壞膠原纖維；3）當(dāng)剛加10x MEM到NaHCO3中的時(shí)候會看到顏色變化，這表明沒有充分反應(yīng)，因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。

1. 細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

1. 趨化試劑

• 細(xì)胞趨化物：作為趨化因子的細(xì)胞    1-5 x 105 cells/ml   
• 培養(yǎng)基：建議使用同一種培養(yǎng)基，并且需要優(yōu)化一下血清濃度，建議使用低濃度的血清，減少由于血清造成的生長因子而減弱了趨化造成的影響。

1. 實(shí)驗(yàn)步驟

開始細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前，要準(zhǔn)備一個濕盒將細(xì)胞趨化載玻片放在濕盒中?？梢杂靡粋€放了浸濕的紙巾的10cm培養(yǎng)皿作為濕盒（如圖二）。

貼壁細(xì)胞準(zhǔn)備：

• 如圖，用小塞子將C、D、E、F塞緊。使用20μl的槍頭從A中加入6μl細(xì)胞懸液。并使用同一個槍頭立即從B孔向外吸。直到觀測通道被細(xì)胞懸液充滿。
• 在注液孔中加入培養(yǎng)基到圖示位置（圖三(B)）。移走所有小塞子。將載玻片放在培養(yǎng)箱中等待細(xì)胞貼壁。

圖三：(A)示意向觀測通道中加入帶觀測細(xì)胞懸液。(B)圖表示注液孔的切面圖。

• 1-5小時(shí)后，用顯微鏡檢查細(xì)胞是否貼壁，如果貼壁，需要更換培養(yǎng)基。用小塞子將C、D、E、F塞緊。從A中加入10μl新鮮培養(yǎng)基。注意不要加入氣泡。同樣用同一個槍頭從B向外吸。
• 重復(fù)三次。
• 在注液孔中加入培養(yǎng)基到圖示位置（圖三(B)）。移走所有小塞子，將A、B孔塞緊，準(zhǔn)備開始趨化實(shí)驗(yàn)。

圖四：細(xì)胞貼壁后用無細(xì)胞培養(yǎng)基更換觀測通道中的培養(yǎng)基。

3D細(xì)胞準(zhǔn)備

• 如圖，用小塞子將C、D、E、F塞緊。使用20μl的槍頭從A中加入6μl細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液。并使用同一個槍頭立即從B孔向外吸。直到觀測通道被細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液充滿。
• 在注液孔中加入基質(zhì)膠到圖示位置（圖五(C)）。移走所有小塞子。小心將A、B孔塞緊，將載玻片放在培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待膠凝固后開始趨化實(shí)驗(yàn)。

圖五：(A)向觀測通道加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液。(B)用同一個槍頭從另一個孔中向外細(xì)。(C)注液孔切面圖。(D)將A、B口塞緊，開始趨化實(shí)驗(yàn)。

加入趨化細(xì)胞：

• 細(xì)胞貼壁或膠凝固后，將C、D兩個孔用塞子塞緊。從E中加入65μl新鮮培養(yǎng)基，充滿整個儲液池。（圖六）
• 再小心移除C、D兩孔的塞子。把E、F兩孔塞緊，同樣的操作從C加入65μl培養(yǎng)基。
• 用20μl槍頭從C中加入15μl作為趨化因子的細(xì)胞懸液，用同一個槍頭從D中吸出15μl。
• 重復(fù)上步操作，加入總量30μl的細(xì)胞懸液。
• 將所有孔塞緊，靜置30分鐘后，就可以進(jìn)行圖像采集。

圖六：加入作為趨化因子的細(xì)胞。需先用無細(xì)胞的培養(yǎng)基將儲液池充滿，再逐漸加入細(xì)胞，加入后將所有塞子塞緊靜置一會，再開始實(shí)驗(yàn)。

●對照，在兩邊儲液池中均加入60μl的無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對照（-/-），和兩個儲液池均加入30μl細(xì)胞懸液作為陽性對照（+/+）。
●按說明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集。
●將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點(diǎn)，開始錄制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

三、圖像處理
1.手動細(xì)胞軌跡追蹤
●下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
●導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開始記錄細(xì)胞軌跡
●選擇一個細(xì)胞，按照時(shí)間點(diǎn)單擊細(xì)胞，*點(diǎn)擊后，會有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點(diǎn)擊，都將在這個新窗口中產(chǎn)生一個該細(xì)胞隨著時(shí)間的新坐標(biāo)
●統(tǒng)計(jì)完足夠的細(xì)胞軌跡后，保存軌跡坐標(biāo)表格
●至少收集30個細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，避免同一細(xì)胞追蹤兩次，去除由于凋亡會而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞
●可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導(dǎo)出

2）全自動細(xì)胞軌跡追蹤
使用ibidi的WimTaxis自動分析平臺，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個工作日后，會得到細(xì)胞軌跡的坐標(biāo)表格數(shù)據(jù)結(jié)果。

四、數(shù)據(jù)處理

使用遷移指數(shù)（ Forward Migration Indices*，F(xiàn)MIs）作為比較趨化實(shí)驗(yàn)和對照試驗(yàn)的參數(shù)。在有趨化物的情況下，空白對照的FMI和與趨化物垂直方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)（FMI┴）應(yīng)是在0點(diǎn)左右。而與趨化物平行方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)（FMI‖）與0點(diǎn)有顯著的區(qū)別表現(xiàn)出了化學(xué)趨向性。同時(shí)，使用Rayleigh Test**對細(xì)胞趨化的方向性進(jìn)行檢驗(yàn)。如果p值大于0.05表示了細(xì)胞運(yùn)動的無序性，表明沒有方向性的遷移。此外，遷移速率等參數(shù)也能直接用于分析。
*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  
**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993)